Глава 3. Токсиколого-гигиенические аспекты

1. Основные положения

      Во все времена пища человека содержала вещества, которые в определённых условиях и при достаточной концентрации представляли опасность для жизни или здоровья. Это могли быть естественные составляющие продуктов питания, например ядовитые вещества из рапса⁷ и других кормовых культур» вызывающие увеличение щитовидной железы, или цианогенные гликозиды из маниоки. Кроме того, опасные и вредные вещества могут образовываться как реакция растений на внешние патогенные факторы (так называемые фитоалексины; например, соланин или хаконин в картофеле) или в результате микробиологического поражения продуктов питания (микотоксины и др.). Из-за высокой ядовитости большинства микотоксинов этот вид заражения представляет собой серьёзную проблему [1, 2]. Поскольку целенаправленное и квалифицированное применение консервирующих веществ может препятствовать образованию микотоксинов, консерванты вносят существенный вклад в безопасность нашего питания.

     Ранее вспомогательные вещества и пищевые добавки (в том числе консерванты) применяли в продуктах питания без особой проверки. Достаточным доказательством их безвредности считалось отсутствие непосредственных негативных последствий для здоровья при употреблении пищевых продуктов с этими добавками. Таким способом человечество «тестировало» вещества, добавляемые в пищу (как, впрочем, и самоё пищу).

     Со времён бесконтрольного использования «химикалий» в консервировании пищевых продуктов берёт своё начало заметная ещё и сегодня (хотя уже уменьшающаяся) неприязнь многих людей к пищевым консервантам вообще. В XX веке (особенно с 50-х годов), в связи с развитием такой науки, как токсикология, положение принципиально изменилось. Вспомогательные вещества и пищевые добавки разрешаются к использованию в продуктах питания только в том случае, если их токсикологические испытания (проведенные в соответствии с современными научными требованиями) не дают оснований предполагать наличие какого-либо вреда от них. Законодательство о пищевых добавках исходит из принципа «запрета с разрешающей оговоркой». Изначально все пищевые добавки запрещены; применяться могут только те из них, для которых чётко оговариваются предельное количество и область применения. Сегодня токсичность вспомогательных веществ и пищевых добавок изучена лучше, чем токсичность многих продуктов питания и их компонентов. Это связано с тем, что к природным

ядовитым составляющим пищевых продуктов общественность всегда проявляла несравнимо меньший интерес, чем к пищевым добавкам.

     При токсикологической оценке вспомогательных веществ и пищевых добавок исходят из того, что между дозировкой и продолжительностью действия, с одной стороны, и наблюдаемыми последствиями, с другой, имеется причинно-следственная связь, которая может быть выражена математически (зависимость доза-действие), и что существует некоторая доза, ниже которой вещество не оказывает влияния на организм (допустимая доза, пороговое значение). Эта доза должна быть определена. Причём следует констатировать не факт проявления действия, как обычно делается в фармакологии, а факт его отсутствия - непривычная для научной теории и практики задача. Сказанное о допустимой дозе не относится к канцерогенным и генотоксичным веществам, так как для такого рода веществ пороговое значение не может быть определено по причине их особенно широкого биологического действия⁸ (ковалентные модификации ДНК) [3].

     Еще Парацельс в 1538 году в третьем из семи своих основополагающих определений (Epistola dedicorate St.Veit) следующим образом сформулировал тог принцип, что нужно принимать малые дозы веществ, чтобы они не оказывали острого ядовитого действия: «Всё содержит яд, / и всё есть яд, / и ничего нет без яда,/ только доза делает / вещь чистым ядом. / Например, любая еда / и любое питьё, / принимаемые не в своей дозе, / становятся ядом, / что приводит к выводу: / это я сам позволяю / яду быть ядом».

     Парацельс хотел этим сказать не только то, что любое вещество становится ядом начиная с определенной дозы, но и что существуют дозы, ниже которых отсутствует токсические действие яда.

      Требуемый объём исследований и методы их проведения определяются имеющейся или предполагаемой потребностью в проверяемом веществе. В экспериментах с животными сегодня существует целый ряд экспресс методов in vitro, в которых могут быть исследованы такие параметры, как генная токсичность и мутагенноси. (см. 4 и 5 гл. 3). «Раздражающее действие» и «проникновение через кожу» также изучаются в тестах in vitro (например, «хорионаллантоидный» тест). Подобным образом изучается и острая генная токсичность (например, Neutral Red uptake inhibition test). Однако все известные тесты in vitro, даже в совокупности, не могут полностью заменить испытания на животных. Тестирование in vitro позволяет лишь уменьшить число таких испытаний [4]. Кроме того, в каждом отдельном случае необходимо решать вопрос правомерности переноса результатов, полученных in vitro, сначала на животных, а потом и на человека.

     Основные сведения для токсикологической оценки получают в экспериментах in vitro. Предпочтительно использование мелких животных с коротким временем жизни - мышей, крыс и других грызунов, собак, обезьян; в отдельных случаях используют иные виды животных. Всех их специально разводят и содержат в определённых условиях. Для решения некоторых фармакологических задач подопытных животных разводят методами генной инженерии, которые дают отличные модели для экспериментов.

      На следующем этапе биохимическое поведение вещества и его обмен у человека исследуются под врачебным контролем на добровольцах (как и при изучении лекарств). Вследствие этого риск перенесения на человека результатов, которые получены в экспериментах с животными, сильно уменьшается.

      В настоящее время для оценки безопасности вспомогательных веществ и пищевых добавок в качестве главных рассматриваются следующие критерии:

      — острая токсичность;

      — метаболизм и токсикокинетика;

      — генотоксичность / мутагенность;

      — репродуктивная токсичность, включая тератогенность и влияние на способность к 

           воспроизведению потомства;

      — субхроническая токсичность;

      — хроническая токсичность;

      — канцерогенность.

   Последовательность оценки токсикологической безопасности вспомогательных веществ и пищевых добавок представлена схемой на рис. 1. Отдельные исследования часто проводят одновременно; например, опыты по хронической токсичности сочетают с проверкой на канцерогенность. В исследованиях по обмену веществ определяют, происходит ли накопление проверяемого вещества в организме. Проверяют также, происходят ли биопревращения испытуемого вещества (всасывание, распространение, метаболизм и удаление).

Рис. 1. Принципиальная схема оценки токсикологической безопасности вспомогательных вещества и пищевых добавок:

-    отсутствие риска;

+   есть отрицательные результаты, которые могут иметь значение при использовании проверяемого вещества в продуктах питания

      Применение современных методов токсиколого-гигиенических исследований в институтах, специализирующихся в соответствующей области, даёт уверенность, что используются подходящие виды животных при надлежащем их содержании и кормлении, а также правильно выбираются способ введения проверяемых веществ и их дозы. Соответствующие рекомендации имеются, например, в документах Организации экономического сотрудничества и развития - ОЭСР (Organization for Economic Co-operation and Development - OECD). И наконец, решающим является правильная интерпретация результатов.

     Перед началом токсикологических исследований вещества требуется установить его идентичность, т.е. проверяемое вещество должно быть химически и физически идентично тому, которое в дальнейшем будет использоваться на практике. Поэтому сначала устанавливают точные характеристики проверяемого вещества. Наряду с обычными химическими показателями они должны включать содержание основного вещества и допустимое содержание примесей. Для синтетического соединения или однокомпонентного природного вещества установление характеристик, как правило, проще, чем для многокомпонентных природных веществ. Для первых известен путь синтеза, есть указания на возможность наличия побочных продуктов, которые обычно удаляют из испытуемого вещества с помощью очистки (перекристаллизации, перегонки и пр.). Поскольку сами вспомогательные вещества и добавки применяются в пищевых продуктах в малых количествах, то примеси к ним (содержание которых составляет миллиграммы или даже микро-граммы на 1 кг) попадают в пищевой продукт ещё более разбавленными.

    Желательно, чтобы пищевые добавки не проявляли фармакологического действия. Это требование предъявляется и к консервантам. Казалось бы, для них оно особенно актуально, так как, обладая антимикробной активностью, консерванты, в принципе, могут применяться против возбудителей болезней (например, дерматомикозов). Реально фармакологическая эффективность веществ, используемых в качестве пищевых консервантов, мала и её можно не учитывать. Вещества, находящие практическое применение в медицине (например, некоторые антибиотики), не используются в качестве пищевых добавок из-за опасности привыкания к ним.

2. Острая токсичность

     Показатель острой токсичности - средняя летальная доза⁹ (LD ₅₀) даёт грубую оценку токсикологических свойств вещества при одноразовом приёме [5]. Она представляет собой дозу, при которой погибает (предположительно) 50% подопытных животных, и зависит от многих факторов - вида животных, их возраста, массы, пола и условий содержания. Для того чтобы можно было сравнивать показатели острой токсичности различных веществ, все эти факторы должны быть стандартными.

    Показатель острой токсичности указывают в миллиграммах проверяемого вещества на 1 кг массы тела подопытного животного. Чем выше значение LD ₅₀ ,тем меньше острая токсичность вещества.

    Для газообразных веществ показателем острой токсичности служит средняя летальная концентрация (LD ₅₀), измеряемая в миллиграммах на 1 л воздуха. От показателей LD ₅₀ и LС ₅₀ следует отличать среднюю эффективную дозу (ED ₅₀) - дозу, которая оказывает определённое действие на 50% животных.

    Для определения LD ₅₀ испытуемое вещество в различных дозах дают группам животных, состоящим из 5 мужских и 5 женских особей. Вспомогательные вещества и пищевые добавки вводят только перорально. Исследуемая доза вводится единовременно с помощью зонда; если она слишком велика (например, при очень малой токсичности), её можно давать частями, но в течение одного дня. Животные наблюдаются не менее 1-2 недель.

    Показатель острой токсичности прежде всего даёт информацию, необходимую для определения места испытуемого вещества в ряду известных соединений. Кроме того, в испытаниях на острую токсичность получают сведения о характере токсикологического Действия - при вскрытии трупов животных в отдельных случаях можно установить, какие органы особенно подвержены действию тестируемого вещества, Эти наблюдения служат отправной точкой для дальнейших токсикологических исследований, в частности LD ₅₀ даёт ориентиры для определения диапазонов дозировок в тестах на субхроническую и хроническую токсичность. И наконец, определение острой токсичности позволяет получить информацию об ожидаемом риске для человека в случае аварии, злоупотребления или профессиональной работы с данным веществом.

    В зависимости от значения средней летальной дозы вещество можно отнести к одному из следующих классов:

LD _{50  мг}/кг                 Класс токсичности

Менее                                        51-й

5-49                                            2-й

50-499                                          3-й

500-4999                                        4-й

Более 5000                                         5-й

     Данные, приведённые в табл. 2, показывают, что вещества, применяемые в качестве консервантов, относятся к 4-му и 5-му классам токсичности. Исключение составляют нитриты

(3-й класс токсичности).

     В соответствии с постановлением ОЭСР №401 (проверка острой токсичности) описанные выше опыты для определения острой токсичности с 1991 года по научным и этическим соображениям заменены значительно более прогрессивной (сточки зрения защиты животных) процедурой

«Fixed - dose - procedure» [6].

3. Исследование метаболизма и токсикокинетики

    Сведения о всасывании и возможных превращениях испытываемого вещества в организме имеют для его общей токсикологической оценки такое же значение, как и данные об органах, подверженных его воздействию. Опыты сначала тоже проводятся на животных.

Таблица 2.   Средняя летальная доза некоторых веществ,

 проявляющих консервирующее действие

       Особо важны исследования на животных, которые метаболизируют тестируемое вещество подобно человеку, так как на следующем этапе к опытам привлекают добровольцев (под врачебным контролем).

       В предварительных опытах на животных формируются общие представления о вероятном поведении тестируемого вещества в организме, in vitro проверяется его устойчивость к кислотному, щелочному и ферментативному гидролизу, действие на изолированные органы, клетки и одноклеточные организмы.

       Чтобы проследить путь вещества в организме, его вводят в нормальной и повышенной концентрациях и изучают превращение и выделение самого вещества и метаболитов в биологических жидкостях, органах и тканях. С помощью повышенных доз выясняют зависимость метаболизма от дозировки (появление иных метаболитов при «перегрузке» обычных путей превращения). Устанавливают, в каком органе или ткани происходят биохимические превращения исследуемого вещества и как они зависят от дозы и времени. Иногда подопытным животным вводят исследуемое вещество, «меченное» радиоактивным изотопом углерода ¹⁴С.

Если наблюдается распад молекулы на несколько частей, то можно использовать соединения, «меченные» двумя изотопами (например, ³Н и ¹⁴С), и обнаруживать их в органах и биологических жидкостях животного по отдельности. Общее распределение радиоактивности в организме подопытного животного исследуется с помощью авторадиографии. Для этого животное (мышь или крысу) после введения исследуемого вещества умерщвляют и подвергают глубокому замораживанию в жидком азоте. Гистологические срезы радиофотографируют. Полученные изображения позволяют визуально наблюдать распределение общей радиоактивности в организме животного.

     При авторадиографии нельзя различить исходное вещество и метаболиты. Это можно сделать для каждого отдельного органа, подвергнув его ткани экстракции и разделив экстракт методом ВЭЖХ с детектором по радиоактивности. Для выяснения структуры метаболитов используются УФ- и ИК- спектроскопия, ЯМР- спектроскопия на ядрах ¹⁴Н и ¹³С и масс- спектрометрия. Исследования метаболизма составляют основу для дальнейших опытов по изучению субхронической и хронической токсичности.

     Существует несколько вариантов участия консерванта в обмене веществ. Нерастворимые вещества, как правило, проходят неизменёнными через кишечник, и в этом случае на биологическое воздействие вне желудочно-кишечного тракта или появление метаболитов рассчитывать н« приходится. Предварительно должно быть точно установлено, что исследуемое вещество не подвергается изменениям под действием кишечных бактерий и не всасывается в виде продуктов распада. Иногда у весьма мелкодисперсных веществ появляется возможность прямого перехода из кишечника в кровеносную систему в результате пиноцитоза или фагоцитоза. Соединений, относящихся к первой группе, среди консервантов нет.

     Вторая группа веществ хотя и всасывается из желудочно-кишечного тракта, но химическому превращению не подвергается. Они не дают токсичных метаболитов и могут неизменёнными выводиться с мочой. При испытании таких веществ необходимо проверять, не происходит ли их превращение под действием кишечной микрофлоры. Среди этой группы консерванты также отсутствуют.

     Вещества третьей группы всасываются из желудочно-кишечного тракта, но после биохимического разложения или превращения (биотрансформации) выводятся из организма. На первом этапе они, например, окисляются, а затем, на втором этапе, приобретают гидрофильность (связываясь с глюкуроновой, серной, фосфорной кислотами или иным путём), а вместе с нею и способность к выведению из организма. Для веществ, метаболизирующихся подобным образом, характерны достаточно быстрые биохимические превращения и отсутствие накопления метаболитов в организме. Примером может служить бензойная кислота, которая в организме человека образует с глицином гиппуровую кислоту и в таком виде выводится с мочой¹⁰.

    Четвёртую группу образуют соединения, которые всасываются и метаболизируются подобно веществам третьей группы, но их выведение или выведение их метаболитов происходит относительно медленно. Такие вещества могут накапливаться в организме, что нежелательно. Примеры консервантов этого вида - борная и салициловая кислоты.

     Последнюю группу составляют соединения, которые организм после всасывания использует так же, как обычные питательные вещества. Они подвергаются биохимическому разложению, подобно компонентам пищи - жирам, белкам₍ углеводам и пр. Примерами веществ такого рода являются пропионовая и сорбиновая кислоты.

4. Генотоксичность

    Под генетической токсичностью (генотоксичностью, мутагенностью) вещества понимают его способность оказывать вредное воздействие на наследственность, т.е. вызывать нежелательные мутации. Спонтанно мутации происходят у любого живого организма, но они быстро исправляются определённой «ремонтной» системой. Мутации, вызываемые генотоксикантами, возникают в результате связывания последних с ДНК, торможения репарационной системы и т.д. В соответствии с характером изменения генетического аппарата различают мутации генные, хромосомные и геномные.

    Генные, или точечные, мутации заключаются в изменении химической структуры генов. К ним относятся:

    транзиция — обмен пуринового основания на пуриновое или пиримидинового на пиримидиновое;

    трансверсия — обмен пуринового основания на пиримидиновое или наоборот;

    инсерция — вставка одной или нескольких пар оснований;

    делеция  — выпадение одной или нескольких пароснований.

    Инсерцию и делецию называют также мутациями со сдвигом рамки.

    Хромосомные мутации (в отличие от генных) отражаются на внешнем виде хромосом, наблюдаемом в световой микроскоп. Вещества, которые вызывают хромосомные мутации, называются мутагенами. Важнейшими типами хромосомных мутаций являются:

    делеция  — утрата части хромосомы;

    дупликация — удвоение участка хромосомы;

    инверсия — поворот фрагмента хромосомы;

    транслокация — обмен участками хромосом.

    Кольцевые хромосомы тоже подвержены мутациям.

    Геномные мутации подразделяют на анеуплоидии и полиплоидии¹¹. Анеуплоидией называют изменение количества отдельных хромосом - уменьшение (нулли- и моносомия) или увеличение (три-, тетра- и полисомия) их числа, т.е. несбалансированный хромосомный набор. Полиплоидия –это увеличение числа хромосомных наборов соматических клеток по сравнению с обычным диплоидным.

    Для проверки на мутагенность используются как тесты in vitro - с микроорганизмами (бактериями, дрожжами, грибами и др.) и клеточными культурами (в том числе культурами лимфоцитов человека), так и тесты in vitro - с растениями, насекомыми (особенно вида Drosophila melanogaster), мелкими грызунами (особенно мышами). Так как различные способы испытаний обнаруживают разные, уязвимые для тестируемых веществ места генетического субстрата, необходимо применять несколько методов проверки мутагенности (так называемая «тест батарея»).

    Условия проведения таких испытаний (мутационного теста по Эймсу, теста на трансформацию клетки, теста на хромосомные мутации, микроядерного теста и др.) опубликованы в официальных изданиях. Получаемые результаты требуют исключительно осторожной интерпретации, поскольку ошибки могут быть как в сторону завышения, так и в сторону занижения.

    Самый известный, бесспорно, тест Эймса. Он основан на том, что определенные штаммы Salmonella typhimurium, которые вследствие мутации потеряли свою способность к синтезу гистидина, под влиянием мутагенов могут мутировать в первоначальную форму (ревертанты) и вследствие этого расти на свободных от гистидина питательных средах. Разные штаммы

S. typhimurium (ТА 98, ТА 100, ТА 1535) имеют склонность к различным типам мутации; следовательно, выбором штамма можно получить некоторое представление о типе возникающей мутации. При тестировании по Эймсу могут возникнуть трудности - иногда консерванты оказывают тормозящее действие на S. Typhimurium.

    Наряду со многими другими весьма популярен также микроядерный тест (см. общую литературу).

    Испытания на мутагенность имеют особое значение для токсикологической оценки вспомогательных веществ и пищевых добавок, поскольку мутагенность и канцерогенность (по меньшей мере для генотоксичных веществ) почти всегда встречаются одновременно.

5. Репродуктивная токсичность

    Исследования по репродуктивной токсичности включают проверку влияния данного вещества на мужскую и женскую плодовитость и общую способность к продолжению рода, на внутри- и послеутробное развитие, а также выяснение наличия у него тератогенных свойств.

    Под тератогенностью вещества понимают его способность вызывать появление уродств у эмбрионов. Тератогены принципиально недопустимы в качестве вспомогательных веществ в пищевых технологиях и добавок в продуктах питания. В то же время некоторые природные составляющие пищевых продуктов (например, спирт) обладают значительной тератогенностью, а вызываемая спиртом алкогольэмбриопатия считается серьёзной токсикологической проблемой.

    Для проверки на тератогенность беременным животным дают тестируемое вещество в критических фазах эмбрионального развития. Определяют, в частности, число имплантаций эмбрионов, число их ранних и поздних рассасывании, число живых и мёртвых зародышей, положение и распределение зародышей в маточных трубах, массу приплода, уродства скелета и органов.

    В процессе эмбрионального развития различные органы в разное время и в разной степени восприимчивы к тератогенным факторам. Поэтому при изучении тератогенеза важную роль играет время экспозиции.

    К настоящему времени очень хорошо описано тератогенное действие талидомида («контерган-катастрофа»¹²), спирта и диэтилстильбэстрола, который занимает особое место в трансплацентарном индицировании опухолей. Имеются указания на тератогенность антагонистов фолиевой кислоты (аминоптерин) и синтетических прогестинов [7].

6. Подострая токсичность¹³

    Испытания на подострую токсичность имеют обычно продолжительность 28 дней и представляют собой промежуточное звено между исследованиями острой (однократное введение вещества и наблюдение в течение 1-2 недель) и субхронической токсичности (ежедневное введение вещества в течение 90 дней и более, см. 7 гл. З). Путём многократного (обычно

3-кратного) введения вещества за сравнительно короткое время в этих испытаниях пытаются обнаружить возможное кумулятивное токсическое действие тестируемого вещества или его метаболитов. В рамках этих же исследований выясняют, происходит ли адаптация организма к испытуемому веществу и не проявляют ли какие-либо конкретные органы особой чувствительности к нему. Эго можно определить, например, измерением активности различных ферментов печени.

7. Субхроническая токсичность

    При исследовании субхронической токсичности испытуемое вещество скармливают в течение 3-6 месяцев (т.е. в течение срока, составляющего приблизительно 10% продолжительности жизни подопытных животных). Для опытов используют обычно грызунов (крыс, мышей или хомяков) и другие виды животных (собак или свиней). Чтобы иметь возможность обнаружить различия действия в зависимости от пола, включают » опыт равное число мужских и женских особей. Необходимо использовать достаточно большое число животных, чтобы можно было сделать статистическую оценку. В опытах участвует и некоторое количество контрольных животных, которых содержат в тех же условиях, что и подопытных, но им не скармливают исследуемое вещество. Проверяемое вещество применяют в нескольких дозах (не менее трёх). Наивысшая из них должна находиться в области, в которой несомненно можно ожидать токсического действия. Таким образом узнают, какие органы подвержены воздействию испытуемого вещества. В дальнейших опытах уделяют им особое внимание.

    Опыты по субхронической токсичности включают исследования живых животных и их трупов (по окончании опыта).

    У живых животных наблюдают и изучают внешние параметры, такие, как поведение, изменение массы тела, потребление пищи и воды. Проверяют внешний вид и состав мочи и фекалий, наличие в них нефизиологических веществ и других отклонений от нормы. Проводят клинико-биохимические исследования крови и её сыворотки, которые дают информацию о выполнении органами важнейших функций. По окончании опыта животных забивают. Определяют массу главных внутренних органов и затем подвергают их макроскопическому и гистологическому исследованию. Особое внимание обращают на печень и почки, поскольку именно их функции связаны в первую очередь с обменом веществ и секрецией. Часто они реагируют на скармливание повышенных доз определённых веществ небольшим и обратимым увеличением, не сопровождающимся гистологическими изменениями. Это увеличение может быть объяснено биологической реакцией на стрессовую ситуацию.

     Для исследования субхронической токсичности доза тестируемого вещества должна быть выбрана так, чтобы, с одной стороны, токсическое действие было явно заметно, с другой - подопытные животные остались живы. Испытания на субхроническую токсичность, наряду с уже упомянутыми целями (выяснение возможности адаптации к исследуемому веществу, накопления его в организме животного, «обратимости» причиняемого им вреда; определение «целевых органов»), служат и для оценки диапазона доз и способа введения вещества в организм при изучении хронической токсичности (см. 8 гл. 3).

8. Хроническая токсичность

Под хронической токсичностью понимают итоговое действие, которое может быть обнаружено после скармливания вещества в течение 2 лет и более. Скармливание вещества в течение длительного времени позволяет обнаружить такие явления, как канцерогенез или возрастная зависимость восприимчивости определенной ткани. Поэтому опыты по определению хронической токсичности рассматриваются как важный элемент оценки потенциального риска пищевой добавки.

    В опытах по хронической токсичности особенно важно использовать достаточно большое количество животных. Это позволяет дать статистическую оценку ¹⁴ результатам наблюдений, сокращая доверительный интервал вероятности биологического события, и обнаружить редко встречающиеся явления. В остальном используют те же принципы, что и в опытах по субхронической токсичности (см. 7 гл. 3).

   Проверяемое вещество даётся животным в более высоких дозах¹⁵. При выборе доз опираются на результаты предшествующих опытов по субхронической токсичности. Следует учитывать, что определённое количество испытуемого вещества может находиться в пище естественным образом.

   В испытаниях на хроническую токсичность следует соблюдать следующие правила:

   — в качестве наибольшей использовать такую дозу, которая в опытах по субхронической токсичности ещё не оказывала никакого действия;

   — не применять корм с содержанием испытуемого вещества выше 5%;

   — иметь в виду, что результаты, полученные в условиях стресса или в других специфических условиях, могут быть не связаны с исследуемым веществом;

   — использовать диету, сбалансированную по калорийности (при этом следует учитывать, что некоторые вещества в высоких дозах влияют на усвоение пищи);

   — учитывать, что исследуемое вещество в повышенных концентрациях может изменять органолептические свойства корма; иногда это становится причиной частичного отказа подопытных животных от приёма корма и, как следствие, может отрицательно сказаться на их развитии.

    В исследованиях по хронической токсичности наблюдают прежде всего развитие животных, их поведение, функции отдельных органов (имеющие внешние проявления) и ферментативные реакции. Подопытных животных или забивают по окончании опыта, или содержат до наступления естественной смерти. Все животные подвергаются вскрытию. Гистологические исследования в первую очередь проводятся на животных, принимавших высокие дозы испытываемого вещества и имеющих макроскопические поражения, опухоли. Изучаются следующие органы и ткани: лимфатические узлы, молочные и слюнные железы, бедренные кости или позвонки (включая костный мозг), гипофиз, трахеи, лёгкие, сердце, щитовидная железа, пищевод, желудок, тонкий кишечник, ободочная кишка, печень, жёлчный пузырь, поджелудочная железа, селезёнка, почки, надпочечники, мочевой пузырь, простата, яички, яичники, матка, головной мозг, глаза, спинной мозг. Особенности распределения испытываемого вещества в организме могут потребовать исследований и других органов и тканей.

    Результаты исследования должны быть правильно интерпретированы. Крайне важно оценить возможность их переноса на человека и предполагаемый риск. К пищевым добавкам сегодня предъявляют требования по безопасности более высокие, чем к лекарствам. Побочное действие лекарства обычно несоизмеримо меньше той опасности для здоровья, которую оно предотвращает. Поэтому с ним смириться легче, чем с побочным действием пищевой добавки.

    Перечисленные оценки позволяют определить уровень (дозу) потребления добавки, при котором не обнаруживается никакого отрицательного действия. Он называется «уровень, не вызывающий наблюдаемого действия» (no – observed – effect – level - NOEL), представляет собой наивысшую дозу, не оказывающую токсического действия, и служит основой для установления «допустимого суточного поступления» - ДСП (см. 41 гл. З). Отношение дозы, безопасной в долгосрочных токсикологических опытах, к. концентрации в продукте питания называется степенью реальной безопасности.

    В табл. 3 приведены значения степени реальной безопасности некоторых веществ, проявляющих консервирующее действие (чем выше значение степени реальной безопасности, тем менее рискованно применение данного вещества).

Обратим внимание на то, что давно известные вещества, которые многократно рекомендовались международными организациями в качестве консервантов, имеют наименьшие степени реальной безопасности. Уточним, что добавки, разрешённые в качестве консервантов, могут применяться только в довольно малом числе продуктов питания и в определённых законом количествах. В то же время поваренная соль и сахар содержатся во многих продуктах питания не как консерванты, к тому же в концентрациях гораздо больших, чем специализированные консервирующие добавки.

Таблица 3. Степени реальной безопасности некоторых веществ

9. Канцерогенность

    Вспомогательные вещества и пищевые добавки могут приниматься вместе с пищей длительное время, в том числе детьми и подростками, поэтому возможность их участия на различных стадиях канцерогенеза должна быть исследована в высшей степени детально. Как известно, развитие опухолей - процесс длительный и поэтапный. В соответствии с концепцией многоступенчатости он может быть подразделён на следующие фазы: экспозиция, инициация, промотирование, конверсия и прогрессирование [8, 9].

    Согласно этой концепции вещества, с одной стороны, могут действовать как инициаторы рака (например, генотоксичные агенты), а с другой стороны, в качестве промоторов могут способствовать образованию опухолей (например, форболовый эфир или этанол). Только совместное действие инициаторов и промоторов ведёт последовательно через конверсию (превращение предканцерогенных поражений в злокачественную опухоль) и прогрессирование (развитие и распространение метастазов) к формированию общей картины ракового заболевания.

    Инициаторами возникновения рака в большинстве случаев являются генотоксичные вещества, т.е. вещества, способные ковалентно модифицировать ДНК. Наряду с генотоксичными канцерогенами существуют негенотоксичные (эпигенетические) канцерогены [10,11], например сахарин, лимонен или бутилоксианизол, чьё действие обнаружено до сих пор только для некоторых видов животных. В случае генотоксичных агентов важно, является зависимость доза -действие линейной или нет. Например, для формальдегида эта зависимость нелинейная, так что может быть сомнительным наличие порогового значения индуцированного формальдегидом канцерогенеза¹⁷. Поскольку наибольшее значение для образования опухолей имеют генотоксичные агенты, обнаружение ковалентного связывания испытуемого вещества (или его метаболитов) с ДНК (ДНК- аддукта) играет особую роль в выявлении его канцерогенного действия. У человека образование аддуктов ДНК с афлатоксином В₁ может быть обнаружено иммунологически или с помощью ВЭЖХ. Такие способы оценки риска получили название «молекулярная дозиметрия» [3, 12,13].

    Так как появлению опухоли может предшествовать значительный инкубационный период, канцерогенное действие вещества проверяют методом кормления животного в течение всей жизни, начиная с возможно более раннего возраста. Наиболее подходящие подопытные животные - мыши и крысы, поскольку у них невелика продолжительность жизни. Как подопытная, так и контрольная группы животных должны быть достаточно велики. Обычно канцерогенность исследуют на двух видах животных.

    Исследования по канцерогенности продолжительны и дороги; поэтому, атак же из соображений защиты животных (не в последнюю очередь) ведутся интенсивные поиски более быстрых методов испытаний. К сожалению, разработанные до сих пор способы недостаточно надёжны и не могут полностью заменить опыты на животных. Такого рода методом может служить тест на мутагенность (см. 4 гл. З). Однако отсутствие мутагенности не гарантирует отсутствия канцерогенности. Некоторые вещества (преканцерогены), будучи сами по себе в этом отношении безопасными, в организме превращаются в канцерогенные метаболиты (вторичные канцерогены), которые, например, соединяются с ДНК. В результате они действуют как инициаторы канцерогенеза. Для проверки возможности такого взаимодействия тестируемое вещество, меченное радиоактивным изотопом, вводится крысам; через несколько часов или дней из органов подопытных животных (предпочтительно печени) выделяют ДНК и определяют её радиоактивность. Последняя служит мерой количества связанного исследуемого вещества (индекс ковалентного связывания). Канцерогены и не канцерогенные вещества отличаются по величине этого индекса в 1-100 тысяч раз [14]. Существуют и другие способы определения наличия ковалентной модификации ДНК [3].

     При проверке консервантов на канцерогенность их вводят перорально (скармливают). При парентеральном введении появление опухоли в месте инъекции не рассматривается как доказательство канцерогенности, если она остается локализованной в месте ввода и если нет иных доказательств канцерогенного действия. Это связано с тем, что при инъекции (особенно многократной) поражения тканей могут появляться из-за хронического раздражения и воспаления. Такой процесс может не иметь ничего общего с действием исследуемого вещества. Некоторый интерес представляют эпидемиологические исследования канцерогенности веществ, известных и уже длительное время применяемых в пищевой химии. Однако выводы таких исследований спорны из-за трудностей интерпретации результатов. Для разрешённых к применению веществ эпидемиологическое изучение невозможно в любом случае¹⁸.

    Важной проблемой при исследовании канцерогенного действия пищевых добавок является оценка порогового значения, т.е. дозы, которая ещё не вызывает нежелательного действия. Аргументы в пользу постулируемой некоторыми авторами необратимости канцерогенных явлений базируются на исследованиях доза - действие, на экспериментах, которые охватывали несколько поколений подопытных животных, а также на концепции мутаций соматических клеток, как первом шаге канцерогенеза, и переноса возникших дефектов при делении клеток. Проблема экстраполяции результатов опытов с высокими дозами с животных на человека решена ещё не полностью.

    Из опытов на животных известно, что многие вещества, которые в высоких дозах проявляют канцерогенное действие, в малых дозах опухолей не дают (например, формальдегид).

    Кроме того, известно множество веществ, которые в высоких концентрациях проявляют канцерогенное действие и в то же время содержатся естественным образом в продуктах питания (в малых количествах). Некоторые вещества, потребляемые в больших количествах с пищей и напитками (например, спирт), на основании опытов с животными находятся под подозрением, как инициаторы или, в меньшей мере, промоторы опухолей (пищевода, прямой кишки, молочной железы) [15, 16]. Особенно острая ситуация с проблемой канцерогенности добавок существует в США. Там имеет силу закона так называемая поправка Делани («Delaney anticancer clause»). Она гласит, что вещество не может быть разрешено к применению в продуктах питания, даже в ограниченном количестве, если оно проявляет канцерогенное действие у человека или животного в любой, даже самой высокой концентрации. Правда, поправка Делани имеет силу только для добавок, но не для самих пищевых продуктов.

10. Аллергенное действие

    Симптоматика, обозначаемая в обычном словоупотреблении как «пищевая аллергия», в научном смысле делится на истинную пищевую аллергию (как иммунная реакция выработки комплексов антиген-антитело) и реакции непереносимости пищи (не связанные с иммунной системой).

    Вопреки широко распространённому мнению, ответственными за такого рода реакции чаще всего являются не консерванты и вообще не добавки, а естественные составляющие продуктов питания (белки орехов, коровьего молока, хлебных злаков) [17, 18].

     Истинные пищевые аллергии (ИПА) - это так называемые аллергии немедленного типа (реакция типа I), например сенной насморк. Они обусловлены ускоренным образованием специфических антител (иммуноглобулин Е) против аллергена и сопровождаются выделением медиаторов, таких, как гистамин или брадикинин. Эти медиаторы, в конечном счёте, ответственны за симптомы ИПА. Наследственная предрасположенность к такого вида реакциям называется атопией. От ИПА следует отличать так называемую реакцию позднего типа (реакция типа IV), которая протекает с участием не только антител, но и Т-лимфоцитов, макрофагов и т. д. Пример такого рода реакции - аллергия на никелевые украшения.

    От истинных аллергических явлений следует отличать непереносимость продуктов питания (НПП), а также псевдоаллергические реакции (ПАР). НПП может быть вызвана как врождёнными, так и приобретёнными ферментными дефектами (примеры: непереносимость лактозы, непереносимость алкоголя многими жителями Азии) и по своим симптомам (как и ПАР) трудноотличима от истинной аллергии [19, 20].

    Известно, что некоторые красители, антиоксиданты, ферментные препараты и консерванты вызывают аллергию и реакции непереносимости. Для людей, чувствительных к веществам такого рода, на потребительской упаковке продуктовых товаров указываются содержащиеся в них добавки, чтобы эти люди могли воздержаться от их употребления. Что касается конссрвантов, то здесь положение осложняется тем, что некоторые из них могут оказаться в составе пищи не только искусственным, но и естественным путём, так как встречаются в натуральных продуктах. Например, салициловая кислота уже давно не применяется в качестве добавки, но люди, чувствительные к ней, могут страдать от аллергии, так как это вещество встречается в природном продовольственном сырье. Бензойная кислота, а также п- оксибензойная кислота и сё эфиры и встречаются в природе, и применяются в качестве искусственных добавок. Следовательно, оба источника этих веществ могут быть причиной соответствующих реакций.

Из применяемых сегодня консервантов аллергенами считаются прежде всего сульфиты (особенно для астматиков) [21, 22], бензойная кислота [23, 24] и парабены [23]. Пропионовая и сорбиновая кислоты аллергенами не являются [25].

11. Допустимое суточное поступление

    Самым надёжным способом проверки опасности консерванта были бы непосредственные испытания на человеке. Но по известным соображениям они возможны только в конце успешного исследования и только в ограниченном объёме. Поэтому заключения о влиянии на человека приходится делать по результатам опытов на животных.

    Объединённый комитет экспертов ФАО/ВОЗ¹⁹ (JЕСFА) и Научная комиссия по пищевым добавкам Европейского Сообщества (SCF) устанавливают на основе результатов токсикологических исследований величину допустимого суточного поступления - ДСП (acceptable daily intake - ADI). ДСП определяет количество вспомогательного вещества или пищевой добавки (в миллиграммах на 1 кг массы тела в день), которое может потребляться человеком в течение всей жизни. ДСП указывает границу, незначительные нарушения которой допустимы [26,27].

    ДСП равно дозе вспомогательного вещества или пищевой добавки, которая, ещё не оказывает токсического действия в опытах по хронической токсичности (NOEL, см. 8 гл. З), делённой на коэффициент безопасности. Этот коэффициент обычно принимается равным 100. Он может быть больше, если для этого есть особые причины, либо меньше, если речь идёт о веществе, которое является обычной составляющей пищи человека, или если путь распада данного вещества подобен пути распада обычных компонентов пиши [28, 29].

    Коэффициент безопасности учитывает следующие обстоятельства:

    — токсикологические исследования пищевых добавок проводят в основном на животных; перенесение на человека результатов опытов с животными сопряжено с некоторым, пусть даже небольшим, риском;

    — многие животные в расчёте на 1 кг массы тела потребляют пищи больше, чем человек (крыса, например, в 7-8 раз);

    — часто в пище содержится несколько добавок одновременно; хотя синергизм в токсикологии редок, его возможность тоже должна быть учтена;

    —  продукты, содержащие пищевые добавки, потребляются в числе прочих,, и людьми, имеющими особенности метаболизма, - детьми, больными, пожилыми людьми, беременными и кормящими грудью; это вносит дополнительный фактор риска, который учитывается при установлении ДСП; ;

    — значение ДСП устанавливается в расчёте на потребление продукта с пищевой добавкой в течение всей жизни, а также учитывает вариации индивидуального потребления.

    В тех случаях, когда JЕСFА считает, что токсикологическая безопасность вещества выяснена ещё недостаточно, устанавливается временное ДСП. Существенные составляющие продуктов питания, нормальные продукты обмена веществ человеческого организма или вещества очень малотоксичные имеют неограниченное ДСП.

    Если в токсикологической безопасности уже разрешённого вещества появляются сомнения, то статус его ДСП «понижается» с постоянного до временного и предлагается провести дополнительные исследования. Так, 8СР в феврале 1994 года перевела значения ДСП для бензойной кислоты и парабенов (соответственно 0-5 и 0-10 мг на 1 кг массы тела) из постоянных во временные и предполагала по окончании дополнительных исследований в 1996 году заново их обсудить. JЕСFА пока не присоединилась к этому решению, т.е. эти две организации предлагают одинаковые по значению, но разные по статусу величины ДСП, б значениях ДСП, установленных ЛЕСРА и 5СР, могут существовать и количественные различия. В настоящее время для консервантов действуют значения ДСП, приведённые в табл. 4.

Таблица 4. Допустимое суточное поступление некоторых консервантов (по JЕСFА)

*       Групповое ДСП (в пересчёте на кислоту).

**     Кроме продуктов для детского питания, в которые добавление нитритов запрещено.

     Доза исследуемого вещества, лежащая в основе ДСП (т.е. не оказывающая токсического действия, NOEL), указывается на 1 кг массы тела. В то же время, если в опытах на животных исследуемое вещество добавляется в корм, то и приводят его содержание в корме. Для пересчёта доз из одной системы в другую достаточно знать массу животного и количество потребляемого им корма. Примеры приведены в табл. 5.

Таблица 5. Взаимный пересчёт токсикологических данных

Непосредственный переход от ДСП к концентрациям, разрешённым в продуктах питания, затруднителен. Тем не менее установленное значение ДСП необходимо для законодателя, как опорная точка при разрешении добавки и установлении максимальных её концентраций в пищевом продукте. Можно отметить (принимая во внимание коэффициент безопасности), что кратковременные превышения ДСП не несут никакого риска.

Фактическое потребление пищевых добавок обычно значительно ниже ДСП. Расчёты показывают, что потребление консервантов в Германии составляет 1-10% от ДСП [30]; однако есть и исключения, например диоксид серы.

От ДСП следует отличать «допустимый уровень» (permissible level - PL), «терпимый ежедневный приём» (duldbare tagliche Aufnahme - DTA) и «условно переносимое недельном поступление» (provisional tolerable weekly intake – PTWI). Допустимый уровень выражается в миллиграммах на 1 кг пищевого продукта и представляет собой произведение ДСП и массы тела, делённое на долю данного пищевого продукта в усреднённом рационе. Этот уровень указывает предельную концентрацию добавки в продукте питания, при которой его среднестатистическое потребление не приводит к превышению ДСП добавки. Для пестицидов, ввиду отсутствия для них значений ДСП, Федеральным управлением здравоохранения Германии устанавливается терпимый ежедневный приём [31, 32]. Значения условно переносимого недельного поступления устанавливаются ФАО/ВОЗ для тяжёлых металлов и остатков фармакологических препаратов.

12. Смеси консервантов

На практике часто используют смеси различных консервантов. Не исключено, что смеси могут иметь иные токсикологические свойства, чем отдельные вещества. Оказалось, что это не относится к LD₅₀, а также к субхронической токсичности при скармливании 2-20% от LD₅₀ в течение 6 месяцев. Исследования проводили с дегидрацетовой, сорбиновой, бензойной, салициловой, пропионовой кислотами, этиловым, пропиловым и бутиловым эфирами

п- оксибензойной кислоты (частично в виде натриевых солей) и фурилфурамидом. Обнаружено, что только сочетание бензойной кислоты и сульфита ведёт себя в опыте по хронической токсичности несколько хуже, чем каждое из этих веществ в отдельности [33].

Смеси нитритов и сорбиновой кислоты в повышенных дозах проявляют токсическое действие не сильнее, чем соответствующие количества нитрита сами по себе. Скармливание смеси из 13 пищевых добавок, чаще всего используемых в Японии, в течение 12 месяцев показало, что при

10-кратном превышении по отношению к ежедневно потребляемому количеству наблюдается лишь небольшое токсическое действие; это действие было существенным только при 100-кратной передозировке. Среди этих добавок были следующие консерванты: бензоат натрия, сорбат калия, пропионат натрия, бутиловый эфир п- оксибензойной кислоты, дифенил и натриевая соль дегидрацетовой кислоты.

Примечание

^{7 Н}е совсем удачный пример: рапс и другие кормовые культуры в пищу человеку, как правило, не используются.

⁸ Отказ законодательства в признании допустимой дозы для канцерогенных и геноток-сичных веществ вызван их особой опасностью, связанной с необратимостью (по современным представлениям) вызываемых ими негативных последствий.

^{9 К}роме средней летальной дозы для характеристики острой токсичности вещества используют также минимальную летальную дозу (LD₁₀), при которой погибает 10% подопытных животных, и абсолютно летальную дозу (LD₁₀₀) - минимальную дозу, при которой погибает 100% подопытных животных.

¹⁰ Пример не вполне удачный, так как в нём отсутствует первый из упомянутых этапов окисление).

^{11 С}уществует ещё один вид геномных мутаций - гаплоидия, при которой вместо обычных для диплоидных организмов двух наборов хромосом имеется лишь один.

¹² Речь идёт о скандале, связанном с имевшей место в 60-х годах вспышкой рождений уродов у матерей, принимавших во время беременности препарат талидомид (контерган), который рекламировался как успокаивающее средство, в первую очередь именно для беременных.

^{13  З}десь авторы вводят дополнительную градацию токсичности по степени её остроты (эта градация не заявлена в гл.3 1).

¹⁴ Точнее - более достоверную статистическую оценку.

^{15 Т}ак в оригинале. По смыслу должно быть «в более низких дозах».

¹⁶ Заниженное значение - крепкие спиртные напитки имеют концентрацию спирта 40% и выше, соответственно завышено значение реальной безопасности.

¹⁷ Нелинейность зависимости (в математическом смысле) и отсутствие порогового действия не связаны. Скорее линейная зависимость свидетельствует об отсутствии порога действия.

^{18 Т}ак в оригинале.

¹⁹ Специализированные учреждения Организации Объединенных Наций: ФАО - Продовольственная и сельскохозяйственная организация ООН (FАО – Food and Agriculture Organization of the Unated Nations); ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения.